蛋白质2-羟基异丁酰化修饰(Khib)再取得重大进展：Writers、Erasers和修饰底物的发现!
景杰编者按：表观遗传学和基于表观遗传机制的生物医药技术是当前生物学研究的研究热点。表观遗传调控主要分为DNA甲基化、RNA修饰（m6A修饰）和转录后调控以及组蛋白修饰，其中以组蛋白修饰的类型和种类最多、对基因表达的调控也最为复杂。组蛋白修饰除了常见的甲基化和乙酰化外，近些年陆续有其它新型修饰被不断报道。芝加哥大学赵英明教授课题组陆续报道了多达八种的赖氨酸酰化修饰，同时还在组蛋白上鉴定了数百种酰化修饰位点，极大地扩大人们对组蛋白修饰的认识，开辟了组蛋白修饰和非组蛋白修饰研究的新领域，而蛋白质2-羟基异丁酰化就是其中的一种酰化修饰【1】。
2014年赵英明课题组在 Nature Chemical Biology发文“Lysine 2-hydroxyisobutyrylation is a widely distributed active histone mark”【2】，首次报道了一种新型的组蛋白翻译后修饰--赖氨酸2-羟基异丁酰化（Khib），该修饰在物种间广泛存在、在进化上保守，并指出组蛋白H4K8hib对精子细胞的分化起到重要的调控作用。文章合作者有UCSD的任兵教授、洛克菲勒大学的David Allis等人。
以这篇文章为基础，清华大学戴俊彪教授、北京蛋白质中心钱小红教授和赵英明教授合作，于2017年在PNAS发文“2-Hydroxyisobutyrylation on histone H4K8 is regulated by glucose homeostasis in Saccharomyces cerevisiae“【3】，研究发现酿酒酵母通过调节葡萄糖代谢稳态对组蛋白H4K8hib的修饰水平进行调控，初步确定在酵母中去修饰作用由Rpd3p和Hos3p联合介导完成。构建起一个Khib，葡萄糖代谢和酵母时序寿命的功能调控网络。并且对H4K8hib这一新组蛋白标志的功能调控有了更深入的认识。
但是目前的研究还没有在哺乳动物中进行深入研究，特别是关于Khib这一新型酰化修饰调控酶以及发送Khib修饰的蛋白还知之不多。本月初，赵英明教授、清华大学戴俊彪教授、四川大学戴伦治教授合作，在Cell Research发表“Landscape of the regulatory elements for lysine 2-hydroxyisobutyrylation pathway”的文章【4】。研究发现Esa1p（芽殖酵母中）/Tip60（人类）蛋白是Khib转移酶（Writer）；同时确认HDAC2和HDAC3是主要的去Khib修饰酶（Eraser）。对哺乳动物开展全Khib修饰组学，一共鉴定寻找到1725个蛋白上面的6598个Khib位点。哥伦比亚大学的顾伟教授、清华大学陈柱成教授和汪舰教授等人也参与该项研究。该研究为深入研究这些酶如何调控这些底物的分子机制提供的非常清晰的线索和组学数据支持。
景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者，可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案，同时还能为您提供高灵敏度的修饰类泛抗体助力您的研究工作。本文中所有关于Kac和Khib修饰抗体（货号PTM-101, PTM-801，PTM-120，PTM-805）均来自景杰生物。
关键词：2-羟基异丁酰化修饰（Hib）、writers、erasers、Khib proteomics
研究思路和成果：
前期研究显示，乙酰化转移酶（KATs）如p300，除了具有乙酰化转移功能，还具有其他酰化修饰如丙酰化、丁酰化和巴豆酰化转移酶功能，因此，研究者通过对酵母中一系列非必需KATs（不影响细胞存活）敲除后，发现H3K8hib的修饰水平并未发生明显变化（图1A），而对必需KAT——H4核小体乙酰化转移酶催化亚基Esa1p进行核心功能结构域解析和实验验证显示，Esa1p的催化口袋能同时兼容乙酰化基团和Hib基团（图1B），对sa蛋白温敏突变株esa1-531显示，相对于适宜温度25℃，37℃下esa1-531的H4K8hib修饰几乎消失；而在Esa1核心功能结构域点突变株（L264D）和（F312D）中，和野生型相比，H4K8hib的修饰明显下降（图1C和1D）；进一步对含有Esa1亚基的picNuA4 和NuA4复合物进行破坏，同样会引起H4K8hib修饰水平降低（图1E）。体外Hib催化实验同样显示，含有Esa1亚基的picNuA4和NCP底物一起，在Hib-CoA存在下，随着时间推移，同样可以催化H4K8hib修饰从无到有（图1F）。上述实验表面，在体内体外Esa1p均可以执行Khib修饰转移酶“Writer”的功能。
图1. 酵母体内体外实验显示Esa1p可以催化Khib的发生
在上述基础上，作者进一步研究Esa1p在人的同源催化酶Tip60是否同样具有Hib Writer的功能，通过体外构建Hib修饰反应体系（图2A），加Tip60酶抑制剂TH1834（图2B）以及在Hela和HEK293细胞中，体内敲减Tip60、加Tip60酶抑制剂TH1834和过表达FLAG-Tip60(图2C-E), 结果均显示Khib和H4K8hib修饰均发生相应变化。表明Tip60在人类细胞中同样发挥着Khib修饰转移酶的功能。
图2. Esa1p人类同源酶Tip60体内体外实验同样显示可以催化Khib的发生
Writer找到后，接下来就是确认Eraser，按照过去酰化修饰的Eraser大部分属于Sir2家族和HDAC家族， 作者通过体外实验对HDAC家族中11个成员的去Khib活性进行筛选，显示HDAC2和HDAC3具备去Khib活性。在HEK293细胞系体内实验显示，对HDAC1敲减和过表达均未有效改变Khib水平，而对HDAC2和HDAC3单个或者联合敲减和过表达，Khib修饰水平明显受到调控。表明HDAC2和HDAC3在人类细胞中发挥着Khib去修饰酶“Eraser”的功能。
图3. 体内、体外实验显示HDAC2和HDAC3是Khib的主要去修饰酶
找到Writer和Eraser之后，作者开始对Hela细胞进行全景式Hib修饰底物质谱鉴定，3次重复一共鉴定寻找到1725个蛋白上面的6598个Khib位点。对发生Khib修饰的346个酶重点分析Hib修饰与催化功能的关系，其中21个酶高度Hib修饰化，每个均超过10个Khib位点作者选择α-烯醇化酶进行三维结构预测，显示结合底物的区域多个位点均发生了多个Khib，形成一结合口袋, 除此之外，多个重要的酶结合底物区域的关键残基均发生了Khib，上述结果表明，Hib修饰可能在多个重要的关键酶活性和分子调控机制中起着非常重要的作用。
图4. Hela细胞中2羟基异丁酰化修饰全谱和深入分析
总结：本文在前面工作基础上，又进一步首次寻找到Khib的Writer和Eraser，并在真核模式酵母和人源细胞进行了验证。后续的Khib全谱又全面揭示了该修饰可能参与一些重要的调控酶（如糖代谢相关，激酶途径相关等）的功能调控，为有这些酶参与的相关疾病和生物学过程机制研究提供了一个全新的角度和新的idea！
当然关于Khib的工作只是处于起步阶段，还有很多问题有待解答，酰基辅酶A的代谢是如何调控Khib修饰水平？组蛋白Khib修饰和其它的酰化修饰直接是如何crosstalk？Writer和Eraser寻找到了，那么Reader在哪里？是和巴豆酰化Kcr公用相同的Reader？亦或是具有独特的Reader？这些地方依然有待于我们深入挖掘和揭示，修饰的分子机制功能领域正方兴未艾！而未来将一片光明！
参考文献
1. Benjamin Sabari, Di Zhang, David Allis, Yingming Zhao. Metabolic regulation of gene expression through histone acylations. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2017; 18: 90–101
2. Lunzhi Dai, Chao Peng , Emilie Montellier, Zhike Lu, Yue Chen, Haruhiko Ishii, Alexandra Debernardi, Thierry Buchou, Sophie Rousseaux, Fulai Jin, Benjamin Sabari, Zhiyou Deng, David Allis, Bing Ren, Saadi Khochbin, Yingming Zhao. Lysine 2-hydroxyisobutyrylation is a widely distributed active histone mark. Nature Chemical Biology 2014; 10: 365-370
3. Jing Huang, Zhouqing Luo, Wantao Ying, Qichen Cao, He Huang, Junkai Dong, Qingyu Wu, Yingming Zhao, Xiaohong Qian, Junbiao Dai. 2-Hydroxyisobutyrylation on histone H4K8 is regulated by glucose homeostasis in Saccharomyces cerevisiae. PNAS 2017; 114: 8782-8787
4. He Huang, Zhouqing Luo, Shankang Qi, Jing Huang, Peng Xu, Xiuxuan Wang, Li Gao, Fangyi Li, Jian Wang, Wenhui Zhao, Wei Gu, Zhucheng Chen, Lunzhi Dai, Junbiao Dai, Yingming Zhao. Landscape of the regulatory elements for lysine 2-hydroxyisobutyrylation pathway. Cell Research 2017; 1-15
景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。